|
|
|
Серологические методы диагностики герпеса |
Эти методы основаны на определении вирусного антигена или антитела с помощью различных реакций.
Реакция нейтрализации вируса герпеса основана на способности специфических (противовирусных) антител достаточно прочно соединяться с вирусной частицей. В результате взаимодействия между вирусом и антителом вирус герпеса утрачивает способность размножаться в чувствительных к нему клетках, а следовательно, проявлять характерное для него цитопатическое действие или вызывать гибель лабораторных животных.
Реакция связывания комплемента является одной из традиционных серологических реакций, применяемых для диагностики многих вирусных заболеваний. Эта реакция основана на том, что при взаимодействии антигена с антителом образуется иммунный комплекс, который выводится из организма с помощью специального белка, присутствующего в сыворотке крови. Этот белок называется комплементом (от лат. complementum — дополнение), он присоединяется к иммунному комплексу и способствует его выведению из организма. Если в состав этого комплекса входят клетки, например, бактерии или эритроциты, то комплемент вызывает их лизис — растворение или разрушение. В большинстве других случаев комплемент «прицепляет» иммунный комплекс к эритроцитам, которые переносят эту образовавшуюся «конструкцию» с током крови в печень или селезенку, где с помощью фагоцитов происходит его разрушение и удаление из организма.
Реакция связывания комплемента проводится в пробирке или в лунках пластиковой планшетки в два этапа. На первом этапе в исследуемую сыворотку добавляют известный белок (антиген) вируса герпеса. Если в сыворотке имеются противогерпетические антитела, антиген связывается с ними и образовавшийся иммунный комплекс, в свою очередь, связывает комплемент. На втором этапе добавляют так называемую индикаторную (гемолитическую) систему, содержащую другой иммунный комплекс, состоящий из эритроцитов барана (антиген), обработанных сывороткой, содержащей спе-цифические антиэритроцитарные антитела. Возможны два результата реакции. Если в сыворотке отсутствуют ПрОТИВОГерпеТИЧеСКИе аНТИТела, ТО ИММуННЫЙ КОМплекс (антиген-антитело) на первом этапе реакции не образуется и комплемент остается в свободном состоянии. При добавлении индикаторной системы — второго иммунного комплекса — свободный комплемент с ним связывается, что приводит к гемолизу (разруше-нию) эритроцитов. Результаты этой реакции хорошо видны невооруженным глазом. Если противогерпетические антитела присутствуют в исследуемой сыворотке, и образовавшийся иммунный комплекс связывает весь свободный комплемент, то добавление индикаторной системы в отсутствии свободного комплемента уже не приводит к разрушению эритроцитов, которые оседают на дно пробирки.
Реакция связывания комплемента весьма чувствительная, и с ее помощью можно выявлять антитела, присутствующие в концентрации менее 1 мкг/мл. Как и другие серологические реакции, эта реакция может быть использована для выявления как специфических антител по известному антигену, так и для определения антигена по известным антителам.
Реакция агглютинации латекса известна уже око-ло 40 лет и в медицинской вирусологии нашла широкое применение. Ее используют для обнаружения как антител, так и антигенов вируса герпеса в биологической пробе. Ставят эту реакцию в специальных планшетках из синтетического полимера — полистирола. Для ее постановки применяют частицы, полученные из каучукового полимера — латекса, предварительно «нагруженные» заранее известными антителами или антигенами. Если, например, к таким «нагруженным» или, как говорят специалисты, сенсибилизированным известными антигенами вируса герпеса частицам латекса добавить неизвестные антитела, то в случае их иммунологического соответствия латексные частицы склеиваются. Если такого соответствия нет, то латексные частицы оседают на дно полистироловой планшетки в виде «пуговки». Обычно эта реакция проходит очень быстро в течение 3-8 минут, что позволяет применять ее в качестве быстрого выявления вирусных антигенов или антител. Эта реакция имеет особое значение в ранней диагностике герпесвирусных инфекций, позволяя определять IgM-антитела, которые, как известно, вырабатываются иммунной системой в первую очередь.
Иммунофлюоресцентный метод
Этот метод основан на выявлении антигенов вируса герпеса в исследуемом материале с помощью моно-клональных флюоресцирующих антител, обладающих способностью светиться под воздействием световых лучей.
Прямой метод имммунофлюоресценции. Данный метод основан на обнаружении в препаратах комплекса: антиген + меченый флюорохром. Для этого изучаемые образцы, например, соскобы из герпетических высыпаний, обрабатывают кроличьей сывороткой, содержащей антитела к вирусу герпеса, меченые специальным красителем (флюорохромом). В тех образцах, где имеется вирус, меченые антитела связываются с его поверхностными антигенами и остаются после дальнейшего отмывания. При просмотре под ультрафиолетовыми лучами в люминесцентном микроскопе появляется характерное желтое или желто-зеленое свечение. Это исследование продолжается от 1 до 3 часов.
Непрямой метод иммунофлюоресценции. Этот метод основан на обнаружении в препаратах комплекса: (антиген + антитело) + меченый флюорохром. Проводится исследование в два этапа. Препараты на первом этапе обрабатывают немеченой специфической иммунной сывороткой, на втором — меченной флюорохромом иммунной сывороткой. При непрямом методе необходимо использовать дополнительно в качестве контроля препараты, обработанные нормальной сывороткой животного, от которого получена специфическая иммунная сыворотка, с последующей обработкой их меченой иммунной сывороткой.
Иммуноферментный метод
Иммуноферментный анализ (ИФА) является одним из наиболее активно развивающихся направлений диагностики как в нашей стране, так и за рубежом. На сегодняшний день разработано более 30 вариантов различных методов ИФА.
Выявление противогерпетических антител. Для выявления вирусных антител используют метод, который напоминает многослойный пирог, и поэтому его называют «сандвич-тест».
Схема проведения иммуноферментного анализа с помощью ELISA-mecma (enzyme linked immunoadsorbent assay) — метода иммуноадсорбции.
1-я стадия — внесение исследуемых проб, инкубация, промывка. Испытуемый образец (сыворотку больного, содержащую противовирусные антитела) в разных разведениях вносят в лунки пластиковой планшетки, на стенках которой находятся предварительно сорбированные (связанные с твердой основой) синтетические пеп-тиды — аналоги белка-антигена вируса герпеса определенного типа. Далее взвесь инкубируют — выдерживают некоторое время при определенной температуре. После инкубации поверхности лунок неоднократно промывают для удаления несвязавшихся примесей. Если в испытуемом образце сыворотки находятся специфические антитела к этому типу вируса, то на стенках лунок образуется комплекс антиген-антитело.
2-я стадия — внесение конъюгата, инкубация, промывка. В лунки вносят коньюгат — моноклональные антитела к иммуноглобулину человека (антиантитела), конъюгированные (связанные) с пероксидазой — ферментом, полученным из овощного растения — хрена. Далее смесь опять инкубируют и лунки промывают. В конце этой стадии конъюгат, словно прицепной вагон, присоединяется к ранее образовавшемуся комплексу антиген-антитело.
3-я стадия — внесение субстрата, инкубация, остановка реакции, учет результатов. На этой стадии в лунки добавляют бесцветный раствор субстрата для фер-мента пероксидазы. Этот субстрат содержит перекись водорода, которую пероксидаза и расщепляет с образованием окрашенного продукта. После этого реакцию останавливают, добавляя стоп-реагент (раствор серной кислоты), и измеряют оптическую плотность окрашенного раствора с помощью специального прибора — фотометра. Чем выше оптическая плотность раствора, тем выше содержание специфических антител в испытуемой сыворотке.
Определение антител классов G (IgG) и М (IgM) позволяет определить реакцию организма на внедрение возбудителя. Так, если в крови обнаруживают IgG-антитела, то это свидетельствует о том, что когда-то организм встречался с данной инфекцией. Следует сказать, что антитела этого класса имеются у подавляющего большинства взрослого населения. О наличии свежей инфекции свидетельствует факт обнаружения в крови IgM-антител, а при обострении хронической — в крови присутствуют оба класса антител. Таким образом, полученная информация о наличии или отсутствии в крови больного тех или иных антител позволяет врачу определить характер заболевания и выбрать правильную тактику лечения.
Антитела к вирусу герпеса вырабатываются в течение первых нескольких недель после заражения и сохраняются длительное время. Если серологический метод выявляет в сыворотке крови специфические антитела только к ВПГ-2, то это указывает на генитальную инфекцию, поскольку этот тип вируса передается только половым путем. Однако выявление антител к ВПГ-1 не позволяет врачу однозначно утверждать, что у больного генитальный или «простудный» герпес.
Дополнительно определяют антитела к поверхностным вирусным оболочечным гликопротеинам — G2 и G,. Если присутствуют антитела к белку G2, значит, инфекция вызвана ВПГ-2 , а если к Gv то ВПГ-1. Этот серологический тест полезен для выявления типа вируса герпеса у лиц с бессимптомной формой инфекции.
Врачей настораживает отсутствие антител при обследовании беременной женщины. Ведь этот факт может говорить о том, что организм будущей мамы не имеет естественной защиты, и случайное заражение может привести к серьезным последствиям. Но, к счастью, такие ситуации бывают очень редко. Обычно у женщины есть IgG-антитела, которые она передает своему ребенку, чтобы они на первых порах защищали его от герпеса.
Выявление вирусных антигенов. Для определения вирусных белков-антигенов применяется другая моди-фикация ELISA-теста. В этом случае на поверхности планшета (твердой фазе) сорбируется антитело к вы-являемому инфекционному агенту, а уже к нему добавляют испытуемый образец (например, материал из герпетических везикул). При этом в ходе 1-й стадии реакции в случае соответствия антигена, присутствующего в испытуемом образце, сорбированному на поверхности лунки антителу образуется иммунный комплекс антиген-антитело. Далее к этому комплексу, как и в предыдущем случае, добавляют конъюгат (используемое в реакции антитело, связанное с ферментом — пероксидазой), который в данном случае прикрепляется к образовавшемуся комплексу. В результате образуется полная цепочка, и присутствующий в ней фермент пероксидаза, так же как и в предыдущем случае, расщепляет субстрат-хромоген с образованием окрашенного продукта. Если в исследуемом образце вирусный антиген не «узнал» сорбированное к поверхности лунки антитело, то иммунный комплекс, а следовательно, и вся цепочка не образуется, и окрашивания не происходит.
|
|
|
